La caratterizzazione biochimica della polifenolossidasi di Dimocarpus longan fornisce approfondimenti sulla sua efficienza catalitica

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 20322 (2022) Citare questo articolo

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I frutti "occhio di drago" prodotti dall'albero tropicale longan sono ricchi di sostanze nutritive e antiossidanti. Soffrono di imbrunimento enzimatico post-raccolta, un processo di cui è responsabile principalmente la famiglia di enzimi della polifenolossidasi (PPO). In questo studio, due cDNA codificanti il ​​PPO sono stati clonati da foglie di Dimocarpus longan (Dl), espressi eterologamente in Escherichia coli e purificati mediante cromatografia di affinità. Il prepro-DlPPO1 contiene due peptidi segnale all'estremità N-terminale che facilitano il trasporto della proteina nello stroma del cloroplasto e nel lume del tilacoide. La rimozione dei due peptidi segnale dal prepro-DlPPO1 produce pro-DlPPO1. Il prepro-DlPPO1 ha mostrato una tolleranza termica più elevata rispetto al pro-DlPPO1 (dispiegamento a 65 °C rispetto a 40 °C), suggerendo che il peptide segnale può stabilizzare la piega di DlPPO1. La DlPPO1 può essere classificata come tirosinasi perché accetta sia substrati monofenolici che difenolici. Il pro-DlPPO1 ha mostrato la più alta specificità verso il difenolo (–)-epicatechina naturale (kcat/KM di 800 ± 120 s−1 mM−1), che è superiore a quella del 4-metilcatechina (590 ± 99 s−1 mM− 1), pirogallolo (70 ± 9,7 s−1 mM−1) e acido caffeico (4,3 ± 0,72 s−1 mM−1). Le efficienze cinetiche della prepro-DlPPO1 sono rispettivamente 23, 36, 1,7 e 4,7 volte inferiori rispetto a quelle osservate con pro-DlPPO1 per i quattro substrati difenolici sopra menzionati. Inoltre, gli studi di docking hanno dimostrato che la (-)-epicatechina ha un'energia di legame inferiore rispetto a qualsiasi altro substrato studiato. Sia gli studi cinetici che quelli in silico suggeriscono fortemente che la (–)-epicatechina è un buon substrato della DlPPO1 e accertano l'affinità dei PPO verso specifici composti flavonoidi.

Le polifenoli ossidasi (PPO) sono metalloenzimi di rame di tipo III presenti nei batteri1, nei funghi2,3, negli archaea4, nelle piante5, negli insetti6,7 e negli animali compreso l'uomo8,9. La famiglia delle PPO contiene tirosinasi (TYR)10,11,12,13 e catecol ossidasi (CO)14,15. I TYR catalizzano l'orto-idrossilazione dei monofenoli in o-difenoli (attività monofenolasi, EC 1.14.18.1) e successivamente l'ossidazione dei corrispondenti o-difenoli in o-chinoni (attività difenolasi, EC 1.10.3.1), mentre i CO possono solo eseguire quest'ultima attività difenolasica13,16. I chinoni risultanti sono composti altamente reattivi e polimerizzano rapidamente in modo non enzimatico, formando così pigmenti complessi dal giallo al nero noti come melanine17,18.

In vivo, i PPO vegetali vengono tradotti come una proteina precursore (prepro-PPO), corrispondente alla traduzione di circa 600 aminoacidi con circa 60–75 kDa19,20. Un prepro-PPO contiene tre domini distinti; una sequenza di segnale N-terminale, il dominio cataliticamente attivo che ospita il sito Cu-Cu e un dominio C-terminale che protegge il dominio attivo5,20,21 (Figura S1). La sequenza segnale (~ 80–100 aminoacidi) dirige la proteina verso la sua destinazione subcellulare mentre viene tagliata via22,23. Dopo la traslocazione attraverso la membrana tilacoide, la restante proteina passeggero viene trasformata in una forma latente (pro-forma) che generalmente è considerata pari a 45-69 kDa14. Il centro binucleare del rame, dove ciascun rame è coordinato individualmente da tre residui di istidina17,24 situati nel dominio attivo, rimane schermato dal dominio C-terminale, prevenendo efficacemente l'esposizione del sito attivo ai substrati candidati. La latenza viene eliminata quando il dominio C-terminale viene staccato dal sito attivo. In vitro, l'alterazione può essere influenzata da proteasi (ad esempio trypsin, proteinasi K)25, pH acido o basico24, acidi grassi26 e detergenti artificiali (ad esempio sodio dodecil solfato, SDS)17,27,28,29,30,31, 32,33. Sebbene il meccanismo proteolitico naturale sia sconosciuto17, è stato recentemente riportato che i PPO vegetali sono capaci di autoattivazione che può separare autoproteoliticamente l'enzima attivo dal dominio C-terminale34,35,36.